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一、产品概述


   
   1.1什么是ChIP-seq


       ChIP-seq技术结合染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)与高通量测序,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。
       

       1.2产品功能

                     

      ChIP-seq技术是将ChIP与高通量二代测序结合,从基因组范围内检测组蛋白、转录因子等蛋白质结合的DNA区段。研究转录因子及其他与染色质相关的蛋白如何影响表观调控,检测在一些生物过程与疾病中,DNA与蛋白质相互作用调控基因表达的重要性。结合生物信息学分析,能够找到转录因子下游调控的靶基因,为进一步阐明生物学机制提供依据。
       
      1.3技术优势 


       1、全基因组覆盖:ChIP-Seq可在全基因组范围单碱基水平对蛋白结合位点进行筛选与鉴定。

       2、高灵敏度:每个样本可获得数百万条的序列标签,可发现研究基因组上稀有的蛋白结合位点。

       3、高精确率:可获得高水平的信噪比数据,准确区分真实事件与噪音,精确定位蛋白结合位点。
       
      1.4实验简介 


       1.4.1实验原理 

        

      首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。
       应用:(1)判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰;(2)检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位;(3)研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系;(4)CTCF转录因子研究。        

       1.4.2 实验流程

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       获得样品后,首先是细胞核的提取。细胞样品无需此操作,组织样品要经过研磨处理,将组织块处理成单个细胞或细胞核。随后是蛋白质和DNA的交联,使得转录因子紧密的结合在与DNA相互作用的位置,便于后续操作。紧随着是DNA片段化处理,这一步将DNA随机打断,既照顾了测序仪的读长要求,也使得测序更加精确。理想的片段长度为1-3个核小体(150-500bp)。片段化处理之后的样品,经过特异性的抗原抗体结合反应被免疫沉淀下来,而没有结合的DNA蛋白质复合体则被洗掉。
      IP下来的DNA通过连接测序接头和可以识别的条码序列,被制备成了可以用于二代测序的文库。同时片段化后的
总DNA也被制备成文库,作为分析的参考。


1.5 项目执行时间


      实验执行时间和生物信息分析执行时间。
      从样品的检测合格开始,到建库测序及数据分析出结果并完成报告,大约需要40天:
      从实验启动到文库制备完成需要5个工作日,如果样品需要进行蛋白质表达量鉴定和组织完整性鉴定,则额外需要3个工作日,共计8个工作日。前期质检结果我们会在第四个工作日之前以书面的形式通知销售和科研助理。



二、样本准备



2.1 样本要求


2。1。1 新鲜细胞样品
   

若客户送样为培养中的新鲜细胞,我们会对细胞进行细胞计数和蛋白质DNA的交联。对于进行转录因子(polII、CTCF等除外)的ChIP实验,我们会分出部分细胞用于鉴定。具体要求为:

a.       Histone ChIP细胞量>20million,TF ChIP细胞量>100million

b。      客户样品、抗体、样品的完整信息单

c.       新鲜细胞需要我公司进行细胞固定,请务必于送样前一天通知实验人员,准备时间进行细胞处理



2.1.2 已固定细胞
   

若客户自己进行细胞的固定,请务必严格按照销售提供的实验操作步骤进行。对于进行转录因子的ChIP实验,需要准备3份样本,其中2份是固定后的样本,用于ChIP实验,1份是未固定细胞,用于检测目标转录因子在细胞核里的表达量。具体送样要求为:

a.       用于ChIP实验的细胞Histone细胞量每份>10million,TF细胞量每份>50million

b.      与ChIP-seq实验同一批次培养的未固定细胞沉淀2million(管内不应要有液体残留)

c。       客户样品、抗体、样品的完整信息单



2。1。3 组织样品
 

a。       所送动物组织质量应当>100mg,并且组织新鲜。

b。      建议取材后用生理盐水进行漂洗,以去除血渍和污物,并剔除结缔组织          等非研究组织。

c.       将样品分割成100 mg左右的小块,样品分割和处理时应在冰上进行, 防止样品降解。

d。      为确保实验的顺利,建议样品备份1-2份,以防备部分样品降解重新取材、制备或送样,耽误时间。

e.       客户样品、抗体、样品的完整信息单。

f.       若需要长途运输,请将组织样品液氮速冻,干冰运输。



三、样本运输


3.1样品包装

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3.2 样本标识


      在容器表面写清样品名称,且与信息单上一致。不建议用油性笔直接在管壁或管盖上写样品名称等信息,最好将样品名称等 各种信息写在标签纸上,贴在管壁,外面再用透明胶带缠绕一圈(防止标签纸没有粘牢脱落,导致 样品无法应用)。


3.3 样本运输条件


     1、运输过程中需要添加的干冰和冰袋的量与季节、运输时间长短、泡沫盒的 薄厚有关(为更有利于保温,尽量选用大块的干冰,建议将样品用透明胶固定于冰袋上,防止干冰挥发导致样品降解)。 
    2、所有样品尽量保证48小时内运达。
    3、销售请于寄送前告知实验室人员和科研助理,所有样品不支持到付。


四、嘉因生物参与完成的典型案例


2.1 转录因子的ChIP-seq案例


       EglN2 associates with the NRF1‐PGC1α complex and controls mitochondrial function in breast cancer。 (EMBO J, 2016) 
       EglN2/PHD1是一个对乳腺癌发生有重要作用的氧感知器(oxygen sensor)。越来越多的研究表明在氧感知(oxygen sensing)和线粒体作用上两者有功能上配合(cross talk),并且两者在维持肿瘤生长上都有很关键的作用。这篇文章向我们展示了EglN2敲除会降低在常氧和缺氧状态下乳腺癌中线粒体的呼吸。进一步整合分析RNA-seq及EglN2在缺氧状态下ChIP-seq数据 我们发现:NRF1在EglN2激活的基因上有motif 富集,这暗示了NRF1可能是EglN2的共结合因子(binding partner)。进一步,我们通过ChIP-seq数据验证了 EgLN2和NRF1的相互结合。机制上,通过在染色质上形成EglN2/PGC1alpha/NRF1激活复合体,EglN2激活了FDXR的转录并保持了线粒体的功能。进一步,FDXR作为EglN2的一个下游靶基因(effector),导致了乳腺癌的发生in vitro/ in vivo。 作者的发现暗示了EglN2调控了ERalpha阳性乳腺癌中线粒体的功能。

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2.2 组蛋白修饰的ChIP-seq案例


      Conditional Knockin of Dnmt3a R878H inituates acute myeloid leukemia with mTOR pathway involvement  (PNAS, 2018) 
      Dnmt3a是造血系统中表观遗传学的修饰基因和癌症的抑制基因。Dnmt3a 878H是急性髓样白血病(AML)中最常见突变体。本研究采用条件性敲击的方法发现Dnmt3a R878H不足以引起AML。通过单细胞测序(single-cell RNA-seq)结合甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-seq)发现Dnmt3a R878H/WT和Dnmt3aWT/WT的低甲基化和超甲基化区域,通过基因注释发现不同甲基化区域(DMRs)的富集通路参与多能性干细胞和慢性粒细胞白血病(CML)调控,联合RNA-seq发现Dnmt3a R878H/WT诱导的低甲基化有助于mTOR上调。MeDIP分析显示白血病细胞的mTOR基因主体低甲基化。通过RNAi等发现mTOR的上调使CDK1的水平增加,CDK1介导EZH2的磷酸化水平增加来抑制H3K27me3的甲基化水平。通过ChIP-seq分析Dnmt3aR882H/WT和Dnmt3aWT/WT的H3K27me3发现Dnmt3aR882H/WT的H3K27me3甲基化水平和富集程度低于Dnmt3aWT/WT。最终明确mTOR pathway的激活作为一个疾病机制的关键调节剂并且可以通过mTOR来抑制Dnmt3a突变体相关的白血病的潜在治疗效应。

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五、其他应用案例


       案例1 转录因子的ChIP-seq

       FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 activates SEPALLATA2 but inhibits CLAVATA3 to regulate meristem determinacy and maintenance in Arabidopsis. (PNAs, 2016)
       植物分生组织对植物组织和器官的形成是必要的。转录因子FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 (FHY3)是已知的拟南芥生长阶段发挥多重作用,但是它的功能在生殖生长期是不知道的。作者通过对fhy3突变体进行表型分析发现,FHY3在花分生组织决定和茎端分生组织的维持中都具有重要作用。通过ChIP-seq和RNA-seq数据分析发现在花发育过程中有238个FHY3直接结合并转录调控的靶基因(其中138个在fhy3-68突变体中是转录上调的,100个是转录下调的)。根据特异结合位点,作者发现了52个花特异的FHY3靶基因,其中63%(33个基因)在fhy3-68突变体中是上调的,进一步显示FHY3在花发育中的转录抑制作用。作者进一步证实了CLV3、SEP1和SEP2都是FHY3的靶基因。在茎尖分生组织中,FHY3直接抑制CLV3,从而调控WUS来维持干细胞池。在花分生组织中,FHY3直接抑制CLV3,而且激活了SEP2来最终促进花分生组织决定。而且,作者通过遗传分析证实了两个分生组织建立和维持的关键因子WUS和CLV3作用于FHY3的下游。


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图4。1 案例1 实验图

       

       案例2
       H2A monoubiquitination in Arabidopsis thaliana is generally independent of LHP1 and PRC2 activity. (Genome Biology, 2017)
      文章通过拟南芥H3K27me3 和H2AK121ub的ChIP-seq实验和数据,回答了一个悬而未决的植物领域表观遗传的问题,到底组蛋白修饰H2AK121ub是否需要转录因子PRC2的活性。经典模型认为,PCR2介导的H3K27me3是 招募PRC1形成H2AK121ub的不可或缺的一步,也就是说PCR2的活性是H2AK121ub形成所必须的。但是作者发现,在很多情况下,广泛存在的组蛋白修饰H2AK121ub与H3K27me3的分布无关(H3K27me3是由PCR2介导发生的)。通过一系列后续实验,作者认为在很大程度上来说 H2AK121ub的形成与PRC2的活性无关。

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图4。2 案例2 实验图

       

       案例3
       SETDB1 modulates PRC2 activity at developmental genes independently of H3K9 trimethylation in mouse ES cells (Genome research, 2015,IF=11。3)
       小鼠胚胎干细胞中SETDB1独立调节H3K9me3过程中发育相关基因PRC2活性 
       SETDB1是一种促进H3K9 甲基化修饰的组蛋白甲基转移酶。作者首先用ChIP-seq对H3K9me3做了4个重复,结合前人的SETDB1ChIP-seq 实验数据进行比对,得到了两种SETDB1peaks位点:solo peaks和ensemble peaks。ensemble peaks位点附近有H3K9me3峰值,而solo peaks附近没有。对solo peaks位点靶基因进行GO分析,发现大部分基因富集在神经发育调节功能中,而这部分基因又与核心蛋白复合体(PRC2)相互关联。PRC2结合位点附近一般伴随着丰富的H3K27me3修饰,H3K27me3修饰会抑制SETDB1修饰H3K9me3。通过SETDB1敲除,发现H3K27me3减少,神经分化得到促进。

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图4。3 案例3 实验图

    


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