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RNA-seq
RNA-seq

一、 产品概述

 

1.1什么是转录组测序(包括mrnaseq ribo-zero rnaseq

1、mRNA-seq:指利用高通量测序技术对cDNA进行测序从而得到一个样品中几乎所有RNA的信息。

2、Ribo-zero RNAseq:使用RiboZero方法去除核糖体RNA,然后再对其他的RNA(如:LncRNA,mRNA和small RNA)进行建库并测序的方法。

 

1.2产品功能

1、通过mRNA-seq,不仅能够筛选差异表达基因,还可以推测mRNA的结构、识别可变剪位点及cSNP(编码序列单核苷酸多态性)、解析RNA等。

2、Ribo-zero rnaseq:对于RNA质量不高的样本,比如部分降解或者降解程度很严重的RNA,使用此方法测序效果较好。

 

1.3技术优势

 

1.3.1 转录组测序相比于microarray

microarray的本质是核酸杂交,只不过是同时进行上万个核酸杂交而已,因此microarray是个相对封闭的系统,只能检测序列已知的片段的浓度。芯片制造商们通常只针对果蝇、线虫、小鼠和大鼠等实验室经典模式生物生产芯片,目前有许多物种还没有参考基因组或者DNA芯片,如果研究者不能提供所要检测的部分序列就无法构建相应芯片。而转录组测序是个开放的系统,能检测到那些没有参考序列的片段,并且给出序列,从而发现一些以前没有检测到的基因(发现新序列)。转录组测序在本质上是PCR,先用PCR的方法构建测序文库(SOLiD的油包水PCR,Solexa的桥式PCR),随后再以“边合成边测序”或者“连接介导的测序”,得到序列信息。由于在构建测序文库的过程中有PCR放大的过程,因此相对灵敏度较高(需要高覆盖倍数的测序深度配合)。此外,与DNA芯片相比RNA-seq还具有更多优势,DNA芯片是在荧光强度的基础上报告表达的相对值,而由于RNA-seq能够一边读取一边对转录本进行计数,它能够直接测出转录本的丰度。总的来说,RNA-seq不仅能够揭示转录本结构和剪切事件,还能够识别融合基因、等位基因特异性突变等等。

1.3.2 Ribo-zero RNAseq 相对于常规RNA-seq

Ribo-zero RNAseq与常规RNA-seq进行建库前都需要去除核糖体RNA,常规RNA-seq使用Poly(T)探针和mRNA上的Poly(A)尾巴结合,然后,用磁珠来回收这些吸附在探针上的带poly(A)尾巴的mRNA,把mRNA洗脱下来之后,就可以进行下面的建库。但是这个方法有一个缺点,就是它对总RNA质量的要求非常高。一般会要求总RNA的RIN值在8。0以上。如果总RNA有一定程度的降解,那么Poly(T)探针所能吸附到的都是靠近mRNA的3’端的那些片段,而mRNA的5’端的那些断片,就会大部分地被丢失。所以,测序得到的结果就会有很大的偏向性。另外,如果是要测的是长链非编码RNA,也就是LncRNA,也是不能用Poly(T)方法来做的。因为大部分的LncRNA没有Poly(A)尾巴,所以就不能用Poly(T)的探针来吸附。Ribo-zero RNAseq方法设计了吸附核糖体RNA的探针,用探针来吸附核糖体RNA。再用带链霉亲合素的磁珠来吸附这些带生物素标记的探针。磁珠被磁铁吸附在管壁上。而其它的RNA,包括mRNA、LncRNA、和small RNA等RNA则留在上清液当中。实验这样设计,就得到了2个结果。第一点,就是对RNA样本的质量要求不再是很高。部分降解的RNA、或者降解程度很严重的RNA都可以用RiboZero的方法去除核糖体RNA。第二点,就是那些不带Poly(A)尾巴的LncRNA,使用RiboZero方法也可以被测序测到了。所以,现在市场上,大部分的LncRNA建库,都是通过RiboZero的方法,去除核糖体,接下来再进行建库。综上所述:Ribo-zero 方法测序相比于RNA-seq具有高精确度和重复性好的优势,此外,还可以对RNA质量不高的样本进行测序。使用Ribo-zero 方法测序还可以对LncRNA进行测序。

 

1.4 实验简介

1。4。1实验原理

RNA-seq即技术,就是把mRNA,smallRNA,and NONcoding RNA等或者其中一些用技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。

应用:

转录本结构研究(基因边界鉴定、可变剪切研究等),转录本变异研究(如基因融合、编码区SNP研究),非编码区域功能研究(Non-coding RNA、microRNA前体研究等),基因表达水平研究以及全新转录本发现。

1.4.2实验流程

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获得样品后,样品提取总RNA,根据客户的需求,比如测mRNA、ncRNA还是smallRNA等,对总RNA样品进行处理。处理好的RNA再进行片段化,然后反转录成cDNA,获得cDNA文库,接着建库测序。


二 嘉因生物参与的案例


Distinct Transcriptional andAlternative Splicing Signatures of Decidual CD4+ T Cells in Early HumanPregnancy,发表于Frontiers in Immunology。 2017影响因子6.5

 

贡献说明:嘉因生物团队完成了低样本量RNA-seq实验和各种转录组生物信息学分析,并发现了pCD4T细胞和dCD4 T 细胞的基因标志物(genesignature)和同源基因异构标志物(splicing signature

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